Генетическая предрасположенность собак к отрицательным побочным реакциям на лекарственные препараты

Введение

Цель, которая ставится при проведении медикаментозного лечения, - добиться максимального терапевтического эффекта лекарственных средств, применяя их таким образом, чтобы свести к минимуму нежелательные побочные эффекты и взаимодействие с другими препаратами. Медикаментозная терапия, как правило, не бывает простой - разные пациенты, вариабельные по течению болезни, нестандартные схемы лечения осложняют большинство клинических сценариев. Нередки случаи, когда наши попытки прогнозировать, избежать нежелательных побочных эффектов лекарственных препаратов и контролировать их оказываются недостаточными.

На протяжении длительного времени при лечении собак разных пород и возраста мы могли лишь регистрировать такие осложнения в результате воздействия определенных условий внешней среды и других факторов, но не было возможности связать их с определенными локусами генома животных.

В последние годы многие исследователи сфокусирова¬ли свое внимание на генетической основе фармакокинетики (абсорбции, распределении, метаболизме, вы-делении) и фармакодинамики (взаимодействии лекарственных препаратов с такими мишенями, как рецепторы и транспортеры) лекарственных препаратов в организме. Так возникла новая дисциплина - фармакогенетика. Ее важнейшими задачами стали изучение генетической вариабельности популяций и прогнозирование на этой основе индивидуального ответа на медикаментозную терапию.

Эта область знаний может предоставить нам основу для эффективного и рационального прогнозирования исхода болезни практически каждого пациента, поскольку даст возможность точно определять мишени для медикаментозной терапии. По мере завершения расшифровки генома человека и продолжения картирования генов других видов фармакогенетические данные и, в свою очередь, клиническая информация, позволяющая предсказывать ответ пациента на применение того или иного лекарственного средства, по всей видимости, будут шире применяться в ветеринарной практике. По мере того, как будет развиваться наше клиническое мышление в направлении подходов к лечению комплексных болезней, контроля хронических патологий и диагностики редко встречающихся патологических процессов, прогнозирование реакций пациента на схему медикаментозного лечения и вероятности улучшения его клинического состояния станет неотъемлемой частью работы врача.

В настоящее время у нас имеется слишком мало информации относительно связи характерных особенностей пород или популяций животных с риском возникновения нежелательных побочных реакций на лекарственные препараты. До настоящего времени такие попытки основывались преимущественно на учете фенотипа животных, т.е. признаков, которые можно оценить визуально, например, цвета глаз и особенностей шерсти. Фармакогенетический подход к прогнозированию возникновения нежелательных побочных реакций на лекарственные препараты основан на учете уникальных особенностей пациента, позволяющих назначать ему индивидуальную схему лечения.

Таблица 1. Примеры врожденной и приобретенной мимически значимой вариабельности экспрессии ферментов, рецепторов и транспортеров лекарственных препаратов у людей

Как теперь стало понятно, в популяции кажущихся сходными животных может проявиться вариабельный клинический ответ на применение одного и того же лекарственного препарата. В ряде случаев это может иметь генетическую основу, и знание фармакогенетики дает нам возможность изменить практику лечения животных в режиме реального времени. Благодаря сфокусированным скрининг-тестам мы сможем прогнозировать, у каких животных произойдет измененная экспрессия протеина или последовательности гена, которая повысит риск проявления нежелательных побочных реакций на определенный лекарственный препарат или класс препаратов. Фармакогенетика открывает и другие перспективы, вероятно, позволяющие избегать нежелательных побочных реакций на лекарственные препараты или влиять на исход таких событий, меняя средства лечения.

Современная эволюция фармакогенетики

Много лет тому назад возникло предположение о том, что у организмов имеются врожденные механизмы адаптации к воздействию на них факторов внешней среды и средств лечения. В начале ХХ века исследования ряда ученых подтвердили наличие связей биохимических процессов, лежащих в основе метаболизма лекарственных препаратов, с генетическими факторами. Одним из первых сообщил о врожденных отличиях реагирования организма на чужеродные химические вещества Снайдер в 1932 году. На основании результатов предшествующих работ (Fox, Blakeslee и Salmon), описавших утрату чувства вкуса у людей при применении фенилтиомочевины (РТС), он установил, что данное осложнение имеет наследственную аутосомальнорецессивную природу. Позднее, во время Второй мировой войны Арчибальд Гаррод выявил генетическую основу гемолитической реакции, возникающей при лечении примахином у афро-американских солдат. Дальнейшие исследования показали, что такое осложнение обусловлено врожденным дефицитом глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (G-6-PD).

С течением времени изучение фармакодинамики сукцинилхолина, изонизида и дебрисоквина также помогло установить генетическую основу реакций пациентов на эти препараты. Такие ранние сообщения и описания соответствующих случаев послужили основой для современной фармакогенетики.

В дальнейшем использование новых методов значительно ускорило развитие этой науки. В настоящее время в ней наметились два основных направления исследований - фармакогенетическое (применение биохимии и фармакологии для корреляции фенотипических маркеров со специфическими генетическими факторами) и фармакогеномное. Последнее отличается от фармакогенетического анализа тем, что решает более глобальные проблемы. Использование современных технологий, таких как ДНК-секвенирование, картирование генов и биоинформатика, позволяет выявлять различия между пациентами, которые способны стать причиной неодинакового поведения в их организме лекарственных веществ и, соответственно, вариабельного результата лечения ими. Геномный подход позволяет нам изучать основу наблюдаемых реакций на лекарственные препараты и заранее предвидеть их, выявлять новые мишени для средств лечения и назначать индивидуальные схемы терапии с тем, чтобы одновременно снизить стоимость лечения и избежать возникновения нежелательных побочных реакций при его проведении. Ряд примеров клинически значимых врожденной и приобретенной вариабельности экспрессии у людей ферментов, рецепторов и транспортеров лекарственных препаратов приведен в таблице 1.

Ряд недавно сделанных фармакогенетических открытий подтвердил, что для животных такие факторы тоже важны. Собаки - идеальный объект для изучения популяционной генетики. Благодаря выраженным породным отличиям, интенсивному их разведению и коротким периодам времени между появлением новых поколений становится более реальной возможность выявления связи генетических факторов с тем, что происходит после дачи собакам лекарственных препаратов. В ряде статей дается обзор результатов фармакогенетических исследований, проводившихся в медицине и ветеринарии. Данная статья написана с целью суммирования данных о связи генетических факторов с клинически значимыми нежелательными побочными эффектами лекарственных препаратов у собак.

Мутации rена множественной лекарственной резистентности (MDR-1) и р-rликопротеин

Многочисленные источники литературы и известные в настоящее время описания клинических случаев свидетельствуют о наличии генетических связей у ряда пастушьих пород собак с нежелательными побочными реакциями на противопаразитарные и другие препараты. Авермектины широко применяют в ветеринарии для борьбы с эндо- и экзопаразитами. Одно из специфических средств этого класса противопаразитарных препаратов - ивермектин, который вызывает паралич у беспозвоночных организмов вследствие активации ГАМК (гамма-аминомасляной кислоты) или регулируемых глутаматом хлоридных каналов периферической нервной системы. У млекопитающих ГАМК экспрессируется в центральной нервной системе, защищенной гематоэнцефалическим барьером.

Клинические наблюдения свидетельствуют о том, что колли и родственные породы собак наиболее чувствительны к воздействию ивермектинов на центральную нервную систему, что проявляется у них возникновением тремора, интенсивного слюнотечения, комы, депрессии и атаксии. Впервые в 80-х годах прошлого столетия установили, что даже очень маленькие дозы препарата (в 100-200 раз более низкие, чем стандартная) способны вызывать у некоторых (но не у всех) колли и собак родственных им пород такие осложнения. Одной из возможных причин может быть изменение связывания белков, и исследовательский поиск позволил установить, что ивермектин концентрируется в головном мозге у чувствительных к нему колли в значительно большей степени, чем у нечувствительных к препарату собак этой породы.

Как оказалось, причиной этого является делеционная мутация гена MDR-1 (множественной лекарственной резистентности 1), которая приводит к экспрессии большого количества предшественников терминирующих кодонов и, соответственно, изменению аминокислотного состава почти 90% синтезируемого р-гликопротеина. О существовании р-гликопротеина впервые узнали в середине 70-х годов. Это гликозилированный мембранный протеин с молекулярной массой 170 кДа, функция которого сводится к обеспечению врожденной резистентности организма ко многим лекарственным препаратам. Данную функцию р-гликопротеин осуществляет посредством выведения таких субстанций из организма. Р-гликопротеин экспрессируется в ряде тканей: в головном мозге, где он является одним из компонентов гематоэнцефалического барьера, обеспечивающих его целостность; в энтероцитах, на каемчатом крае которых он ограничивает связывание и биодоступность соответствующих субстратов; на поверхности опухолевых клеток, множественную лекарственную резистентность которых он обеспечивает; в проксимальных частях почечных канальцев, где его присутствие ускоряет секрецию субстратов в мочу.

Впервые участие р- гликопротеина в обеспечении гематоэнцефалического барьера было установлено на линии мышей с выключенным геном MDR-1. Исследования, проведенные с ивермектином, показали, что популяция таких мышей в 50-100 раз чувствительнее к неврологическому действию этого препарата по срав-нению с обычными мышами (диким типом). Когда исследователи выявили, что ивермектин служит субстратом для р-гликопротеина, стала понятной связь отсутствия этого белка с проявлениями нежелательных побочных реакций при обработке ивермектином. Выяснилось, почему изменение экспрессии р-гликопротеина, не проявляющего узкой специфичности к субстратам и обнаруживаемого во многих тканях, имеет такое большое клиническое значение.

Определяли частоту возникновения мутаций гена MDR-1 в популяции собак. Оказалось, что почти у 75% колли в США, Франции и Австралии имеется один мутантный аллель, ассоциированный с экспрессией измененного р-гликопротеина. К числу пород пастушьих собак, предрасположенных к такой мутации, относятся, в частности, старая английская овчарка, австралийская овчарка, шелти, английская овчарка, бордер колли, немецкая овчарка, длинношерстный уиппет и шелковистый виндхаунд. У других менее близких колли пород собак неврологические нарушения при обработке ивермектином возникают значительно реже.

Многие применяемые в ветеринарии лекарственные препараты также являются субстратами для р-гликопротеина (таблица 2). Последний может оказывать значительное влияние на их абсорбцию, снижая их биодоступность при пероральном применении. Как было установлено, биодоступность этих препаратов, являющихся субстратом для р-гликопротеина, для линейных мышей с выключенным геном MDR-1 значительно выше, чем для мышей дикого типа. Начался поиск возможностей извлечения пользы из такой находки. Обнаружили, что при пероральной даче совместно с ингибитором р-гликопротеина биодоступность доцетаксела, также являющегося субстратом р-гликопротеина, повышается почти в 20 раз. Поскольку многие лекарственные препараты распределяются в организме по тканям, то и в данной ситуации р-гликопротеин играет важную роль. Для тех субстратов, которые могут дать нежелательные побочные реакции в случае попадания в центральную нервную систему, семенники или плаценту, риск возникновения таких осложнений у пород собак с высокой инцидентностью делеционных мутаций гена MDR-1 возрастает даже при назначении препаратов в очень низких дозах. Гетерозиготные по данной мутации животные первоначально могут не проявлять нежелательных побочных реакций при таком лечении, но при назначении соответствующих лекарственных препаратов в высокой дозе или при длительном их применении такие осложнения могут проявиться.

Экспрессия р-гликопротеина в почечных канальцах обеспечивает выделение из организма ряда лекарственных препаратов, особенно химиотерапевтических средств. Одновременное применение ингибитора р-гликопротеина снижает у крыс выделение доксорубицина с желчью и мочой.

Клиническое значение делеционной мутации гена MDR-1 и последующего изменения экспрессии р-гликопротеина станет более ясным, когда у нас появится возможность проверки большого количества собак на уровень экспрессии данного белка. В настоящее время только в одной лаборатории на коммерческой основе можно провести генотипирование проб, взятых у этого вида животных (Университет шт. Вашингтон, www.vetmed.wsu.edu/vcpl).

Ферментативная система цитохрома Р450

В метаболизме лекарственных препаратов принимают участие несколько комплексных ферментативных систем. Ферментативная система СУР450 (цитохром Р450) лучше изучена у человека, но ее исследования проводятся также и у собак. Данный класс ферментов ответственен за метаболизм большого количества лекарственных препаратов. Эти ферменты экспрессируются в ряде тканей организма. Установили, что некоторые лекарственные препараты могут усиливать или ингибировать их синтез; в некоторых популяциях особей они образуются чрезмерно интенсивно, в некоторых - плохо. Имеются различия в их экспрессии и у разных особей.

У 10% небольшой группы биглей обнаружили дефицит СУР1А2. Несколько лекарственных препаратов, применяемых в ветеринарии, оказались субстратами для этого фермента. Дальнейшие исследования позволят уточнить, насколько большую клиническую роль имеет такая находка.

Среди помесных собак существует значительная вариабельность экспрессии фермента СУР2В 11 (этот показатель может различаться у них в 14 раз!). У породы грейхаунд она особенно низка. Некоторые лекарственные препараты, включая пропофол, служат субстратом для фермента СУР2В 11. Имеются также данные относительно различной интенсивности экспрессии данного фермента кобелями и суками.

Ряд наблюдений указывает на то, что ферменту CYP2D 15 может быть присущ полиморфизм у собак. Приблизительно половина популяции собак породы бигль хорошо метаболизирует целекоксиб (субстрат фермента CYP2Dl5), а остальные представители породы справляются с этим плохо. Данный эффект лежит в основе 5-кратного повышения длительности периода полувыведения данного препарата. Если экстраполяция таких наблюдений на другие нестероидные соединения со сходной структурой, например деракоксиб, оказывается необоснованной, дальнейшие клинические наблюдения и исследования могут позволить получить более полную информацию в данной области. Ряд других лекарственных препаратов оказался субстратом для фермента CYP2D 15 человека, но в ветеринарии их применяют значительно реже.

По мере дальнейшего изучения метаболизма лекарственных препаратов в организме собак надо надеяться, будет пополняться наша информация о вариабельности экспрессии ферментов у этого вида животных. Когда мы будем больше знать об источнике таких мутаций, то сумеем установить, у каких пород собак они чаще возникают и на применение каких лекарственных препаратов это может влиять. Благодаря этому в будущем нам удастся избегать опасных взаимодействий лекарственных препаратов между собой, с кормом и присущими различным породам собак генетическими факторами.

Таблица 2. Субстраты р-гпикопротеина 

Цитотоксические лекарственные препараты

Доксорубицин

Винкристин

Винбластин

Сердечные препараты

Дигоксин

Иммунодепрессанты

Цикпоспорин

Противорвотные препараты

Ондансетрон

Противодиарейные препараты

Лоперамид

Антибиотики

Эритромицин

Стероиды

Дексаметазон

Гидрокортизон

Н2-блокаторы

Циметидин

Ронитицин

Другие лекарственные препараты

Ивермектин

Селамектин

Моксидектин

Милбемицин

Морфин

Фенитоин

Рифампин

Амитриптипин

Тиопурин 5-метил трансфераза (ТПМТ /ТРМТ)

Изучение тиопурин S-метил трансферазы человека показало, что этот фермент катализирует метилирование таких лекарственных препаратов, как 6-мер¬каптопурин и азатиоприн. Недавно у собак установили генетический полиморфизм, лежащий в основе значительной вариабельности экспрессии этого фермента. Исследователи (Salavaggione и соавт.) обнаружили, что средний уровень содержания ТПМТ в эритроцитах собаки такой же, как у человека. Более того, отмечена значительная вариабельность содержания данного фермента, метаболизирующего лекарственные препараты. Такая вариабельность проявляется в сходных популяциях собак одних и тех же пород, что напоминает ситуацию, наблюдаемую у людей.

В опыт, проведенный упомянутыми выше исследователями, были включены 56 различных пород собак, а также помесные животные. На первом этапе эксперимента определили уровень содержания ТПМТ в 145 пробах - различия активности фермента в них достигали 9-кратного уровня. Используя данные секвенирования гена и информацию о его структуре, исследователи ресеквенировали все эксоны гена ТПМТ собаки с помощью ДНК 39 животных, выбранных на основании такого критерия, как уровень активности ТПМТ в эритроцитах. В дальнейшем выявили 9 типов полиморфизма по данному признаку, 6 из этих типов были ассоциированы с 67% случаями вариабельности активности ТПМТ в 39 исследованных пробах эритроцитов собак. При анализе этих 6 типов полиморфизма всего одного нуклеотида, проведенном с использованием ДНК всех 145 обследованных собак, в 40% случаев установили связь фенотипической вариабельности экспрессии ТПМТ с данным типом полиморфизма.

Клиническое значение сделанных наблюдений пока еще нельзя оценить в полной мере. Мы знаем, что пациенты с низкой активностью ТПМТ подвергаются значительно большему риску развития потенциально летальной токсичности при лечении стандартными дозами тиопуриновых препаратов. Точно так же при лечении ими в недостаточно высоких дозах чаще сталкиваются с отсутствием улучшений клинического состояния у пациентов с высокой активностью ТПМТ. Сделано наблюдение относительно пониженной активности ТПМТ у ризеншнауцера и очень высоком уровне активности этого фермента у аляскинского маламута. Хотя такая информация пока не может найти клинического применения в условиях отсутствия стандартных методов тестирования активности ТПМТ, тем не менее, ее следует учитывать при оценке клинического состояния животных - вариабельная экспрессия ТПМТ может служить для ряда пород собак фактором повышенного риска возникновения нежелательных побочных реакций при лечении (например, угнетения костного мозга).

Борзые собаки и анестезия

Борзые - группа собак, с доисторических времен одомашненных и разводимых человеком. Известна их предрасположенность к огромному количеству физиологических и анатомических нарушений. Вероятно, этим объясняется высокая инцидентность идиосинкразических реакций на целый ряд классов лекарственных препаратов. Выше упоминалось, что нежелательные побочные реакции часто сопровождают применение анестетиков, таких как пропофол: повышенная чувствительность к ним бывает обусловлена

вариабельностью экспрессии цитохрома Р450. Мы наблюдали и другие реакции, которые в большей степени могли быть связаны с особенностями разведения, физической нагрузкой и работой селекционеров по совершенствованию внешнего облика этих животных.

К борзым обычно относят грейхаунда, уиппета, борзых, ирландского волкодава, басенджи, салюки и родезийского риджбека. Они обладают отличным зрением и на охоте используют именно это свое преимущество, а не ищут зверя по запаху. Для таких собак характерна вытянутая форма тела, чему соответствуют сухая конституция, сильно развитая мускулатура, длинные конечности и глубокая грудь. Собаки этих пород очень чувствительны к воздействию стрессовых факторов и, оказавшись в условиях ветеринарной клиники, они подвергаются сильному стрессу. Отложения жировой клетчатки у них значительно меньшие, чем у собак других пород. Это повышает риск побочных эффектов при назначении им липофильных препаратов (например, барбитуратов), которые могут переходить из головного мозга в мышцы и жир, а затем удаляться из организма печенью. Далеко не все борзые одинаково реагируют на барбитураты и пропафол - на последствия применения им этих препаратов оказывает влияние большое количество факторов, в том числе полиморфная экспрессия генов, вариабельная экспрессия ферментов и влияние окружающей среды.

Идиосинкразическая токсичность сульфаниламидов

Накапливается все больше данных, подтверждающих следующую гипотезу: фармакогенетические особенности пациентов могут усиливать нежелательные побочные эффекты, которые не связаны с концентрацией лекарственных препаратов и непредсказуемы. Такие идиосинкразические реакции многократно регистрировали у людей. Доказано, что сульфаниламидные препараты (сульфаметоксазол, сульфадиазин, сульфадиметоксин) могут вызывать у собак многочисленные осложнения, в том числе гематурию, нерегенеративную анемию, нарушение синтеза гормонов щитовидной железы; их выраженность зависит от дозировки сульфаниламидов. При применении их в терапевтической дозе отмечаются и другие побочные реакции (гепатотоксичность, кожная сыпь, лихорадка, гемолитическая анемия, увеит, полиартрит, протеинурия и отек морды), которые имеют более генерализованный характер и больше походят на иммунологические реакции замедленного типа. Эти реакции могут проявляться даже после короткого периода лечения (в течение 10 дней или меньше), сразу после его окончания. В США в настоящее время изучают особенности собак, склонных к таких реакциям. С этой целью проводят иммуноферментный анализ (ELISA) на наличие у животных антител к лекарственным препаратам, а также цитотоксический (in vitro) и другие тесты.

Заключение

 

Мы дали некоторые разъяснения, которые помогут проверить наличие генетической основы побочных эффектов, наблюдаемых при применении лекарственных препаратов некоторым породам собак. В настоящее время уже создана научно-практическая база, подтверждающая их генетическую предрасположенность к побочным реакциям на лекарственные препараты с учетом особенностей фенотипа животных и поиска генетических связей таких осложнений. Это позволяет идентифицировать предрасполагающие генетические факторы и изменить схемы лечения таким образом, чтобы не допускать побочных реакций. Описано несколько генетических факторов, имеющих клиническое значение в аспекте лекарственного лечения. Фармакогенетика предоставила нам благоприятную возможность выбирать в своей практической деятельности наиболее безопасные схемы лекарственного лечения. Мы получили возможность проводить скрининг животных, относящихся к группам повышенного риска возникновения побочных реакций при применении им лекарственных препаратов, определять их генетические особенности и подбирать схемы лечения на индивидуальной, а не групповой основе. Новые знания в области генетики дадут возможность более точно выявлять новые мишени для лекарственных препаратов, что позволит свести к минимуму нежелательные побочные эффекты лекарственной терапии и добиться максимального эффекта от ее проведения. Академическая и клиническая поддержка фармакогенетических и фармакогеномных исследований имеет важное значение для всей ветеринарии и поможет ей со временем выйти на новый этап развития.